类器官培养基试剂盒组分到货保存及操作步骤与方法介绍
一、类器官培养基
保存条件：4℃条件下可保存3个月。
使用建议：收到货后建议4℃保存，并在1个月内使用完毕。
长期保存：长期不用时建议放于-20℃储存，避免反复冻融超过2次。
组织保存液、原代组织消化液
保存条件：内含维持细胞活性的营养成分，长期不用时建议放于-20℃储存。
注意事项：避免反复冻融超过2次。
1.1 实验材料准备
原代缓冲液：4℃预冷。
组织保存液：用于组织保存。
取样管：用于组织取样和运输。
组织运输箱：用于低温运输。
冰袋：维持低温环境。
1.2 组织的获取与运输
关键步骤：组织取样与运输是类器官构建成功的关键环节。
操作规范：
组织应在离体30分钟内放入组织保存液。
使用原代缓冲液清洗组织3-5次，去除表面血液。
清洗后的组织放入组织保存液中，取样管于4℃低温保存运输（72小时内）。
2.1 实验材料准备
原代缓冲液：4℃保存。
原代组织消化液：37℃预热。
基质胶：提前24小时放入4℃冰箱融化。
类器官培养基：室温或37℃预热。
器械：镊子（10 cm）、尖头眼科手术剪/手术刀片。
耗材：一次性60 mm培养皿、15 mL/50 mL离心管、1.5 mL EP管、100 μm细胞滤网、3 mL巴氏吸管/1000 μL移液枪、24孔细胞培养板。
辅助工具：金属冰盒。
2.2 类器官构建流程
2.2.1 组织的处理
运输条件：取材后的组织建议在2–8℃条件下保存运输。
记录信息：组织拍照并登记详细信息。
2.2.1.1 组织的清洗
操作步骤：
取样管消毒后，在超净台中将组织取出，放入培养皿中。
加入原代缓冲液，用3 mL巴氏吸管或1000 μL移液枪吹打清洗，重复操作三次及以上。
2.2.1.2 组织的解离与消化
操作步骤：
用眼科剪或手术刀片去除组织杂质，镊子转移至1.5 mL EP管中。
进一步机械解离成1~3 mm³的组织块，转移至15 mL离心管中。
加入5-8 mL原代组织消化液，37℃震荡消化15-25分钟。
每10分钟显微镜下观察组织消化情况，直至观察到较多的70 μm以下的细胞簇或单个细胞。
2.2.1.3 组织的过滤
操作步骤：
消化完成后，通过100 μm孔径的细胞筛网过滤，收集滤液。
加入3倍体积的原代缓冲液漂洗终止消化，300 g离心5分钟弃上清。
若细胞沉淀含有红细胞，加入1-2 mL红细胞裂解液1-2分钟后，稀释至10 mL，300 g离心5分钟弃上清。
2.2.1.4 类器官培养
操作步骤：
观察离心收集的细胞沉淀体积量，添加25倍体积的基质胶重悬，形成3D培养空间结构。
24孔细胞培养板按照25-30 μL/孔点胶，基质胶全程维持在0-4℃条件下操作。
细胞培养板放置37℃培养箱中10-15分钟，待基质胶凝固后，每孔添加500-750 μL类器官培养基（提前37℃预热）进行培养。
3.1 实验材料准备
传代缓冲液：4℃保存。
类器官传代消化液：室温或37℃预热。
基质胶：提前24小时放入4℃冰箱融化。
类器官培养基：室温或37℃预热。
耗材：1.5 mL/15 mL离心管、24孔细胞培养板。
辅助工具：冰盒。
3.2 类器官传代流程
3.2.1 类器官消化
操作步骤：
吸掉培养基，每孔添加等体积的传代缓冲液，移液枪轻柔吹散基质胶，收集于15 mL离心管中。
4℃静置10-15分钟或-20℃静置4-8分钟。
根据类器官的生长情况决定是否需要消化传代。
消化液消化：加入1-2 mL类器官传代消化液，室温消化1-3分钟，显微镜下观察至消化完成。
机械消化：加入1 mL传代缓冲液，1 mL枪头吹打20-30次，直至类器官分散。
3.2.2 传代类器官培养
操作步骤：
观察离心收集的类器官沉淀体积量，添加25倍体积的基质胶重悬。
24孔细胞培养板按照25-30 μL/孔点胶，基质胶全程维持在0-4℃条件下操作。
细胞培养板放置37℃培养箱中10-15分钟，待基质胶凝固后，每孔添加500-750 μL类器官培养基（提前37℃预热）进行培养。
4.1 实验材料准备
传代缓冲液：4℃保存。
类器官冻存液：4℃保存。
耗材：15 mL离心管、细胞冻存管。
辅助工具：程序降温盒、移液枪。
4.2 类器官冻存流程
操作步骤：
吸掉培养基，每孔添加等体积的传代缓冲液，移液枪轻柔吹散基质胶，收集于15 mL离心管中。
4℃静置10-15分钟，300 g离心5分钟弃上清。
每三个孔加入2 mL类器官冻存液，轻柔吹打混匀，转至细胞冻存管中，每管1 mL。
做好标记信息，放入程序降温盒中，移至-80℃冰箱中，48小时后放入液氮罐中保存。
5.1 实验材料准备
传代缓冲液：4℃保存。
类器官培养基：室温或37℃预热。
基质胶：提前24小时放入4℃冰箱融化。
耗材：24孔细胞培养板、15 mL离心管。
辅助工具：冰盒、水浴锅、3 mL巴氏吸管/移液枪。
5.2 类器官复苏流程
操作步骤：
从低温环境中取出冻存的类器官，快速置于37℃水浴锅中融解。
将解冻后的类器官快速转移至15 mL离心管，300 g离心5分钟弃上清。
按每管冻存管添加100 μL基质胶重悬，24孔细胞培养板按照25-30 μL/孔点胶，基质胶全程维持在0-4℃条件下操作。
细胞培养板放置37℃培养箱中10-15分钟，待基质胶凝固后，每孔添加500-750 μL类器官培养基（提前37℃预热）进行培养。
保存条件：在2–8℃环境条件下，基质胶过夜解冻。
使用注意事项：使用基质胶时，请将其放在冰盒以防止过早凝固。
凝固时间：基质胶在37℃下20分钟内形成凝胶。
6.1 基质胶特点
流动性：4℃连续14天仍可保持较好的流动性。
凝固性：放入37℃培养箱中10-15分钟即可凝固。
稳定性：培养过程中不易破损，去胶干净不粘培养板。
以上内容为类器官培养基试剂盒的详细操作步骤与方法，涵盖了从组织前处理到类器官冻存与复苏的全流程，确保实验的顺利进行和类器官的高质量培养。
